式細胞儀（Flow cytometer ）是對細胞進行自動分析和分選的裝置。它可以快速測量、存貯、顯示懸浮在液體中的分散細胞的一系列重要的生物物理、生物化學方面的特征參量，并可以根據預選的參量范圍把指定的細胞亞群從中分選出來。
流式細胞術依賴于激光對單個細胞的檢測以及對產生熒光和散射光的信號收集。流式細胞儀包含 3 個主要組件：液流系統、光學系統和電子系統。每個組件都扮演著不同的角色。
液流系統由細胞和鞘液流過的管和玻璃皿組成，對細胞流量和速度都要求高精度。光學系統由激發細胞的光源、檢測細胞熒光和散射光的檢測器、透鏡和濾波器組成。每個裝置必須具有高穩定性和靈敏度，以實現高 精度的細胞分析。電子系統接收來自光學系統的電信號輸出，處理數據，并分析測量結果。
一，基本原理
當用熒光染料標記的細胞懸浮液倒入細管中時，細胞以一定的間隔移動通過細管。然后用激光光束照射這些細胞。從熒光物質發射出的熒光和由細胞散射的光由光電檢測器檢測和監測。
二，激光檢測點
細胞與激光發生相互作用的地方，稱為激光檢測點 。在這里，細胞排成單列通過，而聚焦的激發光穿過細胞流。
流式細胞儀中常用激光器與熒光材料
在流式細胞儀中，最常見的激發光源為激光器。激光具有一致性 （具有同步、相同的波頻率）、 單色性 （具有單一波長）和高能性，這些特點可確保照射到細胞的光是具有特定波長的均一光線。流式細胞儀通常配置一個或多個激光器， 下圖列出了現有儀器的常見激發光源。
三，激光光源的位置設計
流式細胞儀的光源部分會用到多款激光器，多款激光器的位置設計一般有兩種方式：并列式和混合式。
并列式是激光光源并列成一排或一列，細胞通過激光檢測點時，一次暴露于一個激發光源。混合式是所有激光器共用同一條光路，細胞同時被多個激光器激發。并列式和混合式可以同時用于流式細胞儀設備中。
并列式的激光位置設計，由于細胞從一個激光器移動到繼電器中的下一個激光器需要時間，因此，系統會存在一定的時間延遲。
在混合式設計中，兩個激光器位于相同位置，兩個激光器的光束同時激發細胞。兩個激光器共用同一條光路，包括相同的發射濾光片和檢測器。
雖然大多數儀器通常會自動設置時間延遲，但如果需要，也可以手動監控和調整。如果該時間延遲設置不正確，可能會觀察到信號丟失，或者是來自兩個不同細胞的重疊信號。
正確和錯誤延時設置的結果如下圖所示。該實例中使用的熒光顆粒上具有等量的兩種不同熒光染料，一種在488nm激發并發出綠色熒光，另一種在561nm激發并發出紅色熒光。由于兩種熒光染料表達在同一個顆粒上，所以預計它們的事件數相等，并且預計在時間延長設置適當的情況下，它們能夠以相似的模式發射。
圖中A展示了這類實驗的數據。在圖B中，數據剛開始看起來與圖A相似，但是操作者在時間點30時調整了時間延遲設置，并在時間點50再次調整。請注意，下游激光器的熒光（即繼電器中第二個激光器）比觸發激光器（繼電器中第一個激光器）的熒光更低，并且事件的擴散范圍更廣。
四，熒光染料的選擇
針對不同激光光源的位置設計，選用的熒光染料必須有所不同。以并列式激光光源設計為例。假設有兩種激光器，這兩種激光器在不同時間激發同一個細胞，每種激光器具有獨立的檢測器。由于兩種激光器激發同一個細胞存在時間差。因此，可以選擇這樣兩種熒光染料與之對應：接收不同激光時，產生相同波長的熒光。
以流式細胞儀常用的兩種激光器488nm和633nm為例。藻紅蛋白-Alexa Fluor 647（PE-AF647）的激發波長為488nm，別藻藍蛋白（APC）的激發波長為633nm，這兩種熒光染料的發射波長都為680nm。
五，光路的引導
流式細胞儀中很重要的一個部分就是光路的引導。引導光路常用的器件為濾光片和分色鏡。
1，濾光片
濾光片分為三種：長通（LP）濾光片，短通（SP）濾光片和帶通（BP）濾光片。
長通（LP）濾光片允許特定波長以上的所有光通過。 圖7A 的實例是LP 500濾光片，表示波長在500nm以上的所有光均可通過濾光片。請注意，紫外和紫色波長會偏轉，而藍色、綠色和黃色光線可以通過。
短通（SP）濾光片允許低于特定波長的所有光通過。 圖7B 的實例是SP 500濾光片，表示只有波長低于500nm的光可以通過濾光片。紫外線、紫色和藍色光可以通過，而波長較高的綠色和黃色光被偏轉。
帶通（BP）濾光片 可被認為是LP和SP濾光片的交叉組合。只有特定波長范圍內的光可以通過濾光片。圖7C 的實例是一個520/20 BP濾光片，表示只有波長在520nm±10nm內的光可以通過濾光片，或者說是只有波長在510-530 nm范圍之間的光可以通過濾光片。其他所有光將被偏轉。
2，分色鏡
雙色鏡，也稱為二色分光鏡，是具有鏡面涂層的LP和SP濾光片形式。除了可通過特定波長以上（LP）或特定波長以下（SP）的光之外，雙色鏡還可以將光反射到一定方向（如下圖） 。
例如，500LP雙色鏡可傳輸波長在500nm 以上 的光并將波長在500nm以下的光反射到其他方向。525SP雙色鏡可傳輸波長在525 nm以下的所有光，并將波長在525nm以上的所有光反射到其他方向。
該實例中的雙色鏡（或分光鏡）分別與特定檢測器相連。第一個雙色鏡 (1) 可反射紅光并將其引導至紅色檢測器，同時允許低于紅色光波長的所有光通過并傳輸到光路中下一個雙色鏡。第二個雙色鏡 (2) 可反射黃光并將其引導至第二個檢測器，同時允許藍光和綠光通過。最后一個雙色鏡 ( 3 ) 反射綠光并將其引導至第三個檢測器，并允許藍光通過。
儀器中的濾光片、分色鏡和檢測器需要匹配至選擇的熒光染料，這樣才能得到準確的檢測結果。
六，選擇探測器
探測器捕獲由激發態熒光染料和散射激光發射的光子，將它們轉換成電信號，并傳遞到電子系統。流式細胞儀可使用多種類型的檢測器，最常見的類型是光電二極管（PD）和光電倍增管（PMT）。傳統上用于光纖通信的雪崩光電二極管（APD） 已開始被一些流式細胞儀使用，它特別適用于檢測長波發射（> 650 nm）。也有一些儀器使用相機進行檢測，但并不常見。
PD價格便宜，但是靈敏度較低，它們對光電流的放大能力不如PMT。PD通常用于負責處理最明亮的光或信號通道，如前向角散射光通道。
PMT對于低信號水平更敏感，包括SiMP（即硅光電倍增管MPPC），可以使單個光子的能量放大數百萬倍。它們通常用于測量來自細胞的激發態熒光染料的熒光以及側向角散射光信號。PMT的靈敏度也受到施加電壓量的影響，需要根據具有指定配置的指定儀器上的PMT進行優化。濱松的PMT會配備高壓電源模塊，可以實現對電壓和靈敏度的精準控制。
七，流式細胞儀的技術發展趨勢---多色分析
1，什么是多色分析
為了獲得迄今為止流式細胞術中尚未獲得的更多信息，有必要用多種類型的標記物對細胞進行染色。在精確區分各種標記物組合的測量中，利用不同波長的激光器和探測器進行多色分析發揮著積極作用。
傳統的熒光檢測測量通常限于熒光強度高的波長范圍。但是，測量和分析技術的最新進展讓我們能夠獲得整個光譜的熒光信息。這提高了多色分析的精度，并將細胞分析的標準提高到更先進的水平。
2，多色分析面臨的問題
在多色分析過程中，由于在測量中使用了多種熒光染料，不同波長的熒光可能在測量項目之間重疊，由于光泄漏到最初不用于測量的通道中而導致干擾。糾正這個問題的技術稱為補償。為了進行補償，必須預測目標熒光染料之間的熒光重疊并將其從信號中去除。這種補償處理的精度在很大程度上取決于流式細胞儀中探測器的靈敏度特性。
傳統流式細胞術不能一次測量盡可能多的項目，但波長光譜之間的重疊較少，這使得測量更容易執行。如下圖：
多色分析由于一次要測量的項目數量很大，這會導致測量光譜之間的重疊，因此多色分析需要復雜而精確的測量。如下圖：
為了獲得大量的精確數據，必須將檢測波長范圍擴展到近紅外區域，這意味著探測器需要在近紅外區域具有更高的靈敏度。為了滿足這些需求，濱松正在努力提高其用于多色分析的探測器性能。
例如，與在光陰極面中使用堿性材料的傳統光電倍增管相比，不斷提高利用光陰極面中晶體材料的光電倍增管模塊性能，并實現了更高的靈敏度和擴展的近紅外靈敏度。提供一系列光電倍增管，在單個元件中具有多個檢測通道，還提供易于使用的模塊，其功能非常適合多色分析。
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